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Molecular karyotyping by Array-CGH

Microarray-based molecular karyotyping
Molecular karyotyping by Array-CGH
 

Il Cariotipo Molecolare (Array-CGH)

Finalità dell’esame

L’indagine citogenetica fetale (o cariotipo) viene eseguita su coltura di cellule fetali presenti nel liquido amniotico, e prelevate mediante amniocentesi, oppure nei villi coriali, prelevate mediante villocentesi.

La sua finalità è lo studio dell’assetto cromosomico fetale, al fine di evidenziare la presenza di eventuali anomalie cromosomiche, sia numeriche (quali trisomie, monosomie e presenza di un marcatore), che strutturali (traslocazioni, delezioni ed inversioni). Le malattie provocate dalle anomalie cromosomiche sono tra le più importanti cause di abortività, di morte fetale o malformazioni congenite.

Le anomalie Cromosomiche

In seguito a mutazioni il cariotipo può modificarsi nel numero o nella morfologia dei cromosomi che lo costituiscono, dando così origine rispettivamente alle anomalie numeriche dei cromosomi (aneuploidie) e alle anomalie strutturali dei cromosomi.

Le aneuploidie numeriche più frequenti osservate nell'uomo sono la monosomia (assenza di un elemento nella coppia di cromosomi omologhi) e la trisomia (presenza di un elemento addizionale in una coppia di cromosomi omologhi). In questi casi si parla di monosomia e trisomia completa, ma si possono verificare anche monosomie/trisomie parziali, per assenza o presenza in triplice copia di singoli segmenti di cromosoma.

Le monosomie complete sono incompatibili con la vita postnatale, l'eccezione è rappresentata dalla monosomia del cromosoma X, associata alla sindrome di Turner (45,X).

Le trisomie complete di alcuni cromosomi, come la trisomia 21 o sindrome di Down (47,XX,+21), trisomia 18 o sindrome di Edwards (47,XX,+18), trisomia 13 o sindrome di Patau (47,XX,+13) sono invece compatibili con la vita postnatale e sono associate a ritardo mentale e, talora, a malformazioni e difetti di crescita. Anche i cromosomi del sesso possono andare incontro a difetti sia numerici (polisomie, 47,XXY;47,XXX; 47,XYY) compatibili con la vita postnatale, ma spesso sono causa di una sintomatologia più lieve. Le più frequenti alterazioni dei cromosomi sessuali sono la sindrome di Turner, dovuta alla mancanza di un cromosoma X nelle femmine e la sindrome di Klinefelter dovuta alla presenza di un cromosoma X in più nei maschi.

L'aneuploidia è causata, nella maggior parte dei casi, da errori di non-disgiunzione alla meiosi che causano la formazione di due cellule (gameti) che contengono rispettivamente un cromosoma in più ed uno in meno. La causa della non-disgiunzione si verifica con maggior frequenza nella meiosi femminile ed aumenta con l'età. Da ciò deriva un aumentato rischio di patologia cromosomica fetale in madri di età superiore o uguale a 35 anni.

Patologia

Anomalia cromosomica

Frequenza alla nascita

Sindrome di Down

47,XX(oppure XY),+ 21

1 :700

Sindrome di Edwards

47,XX(oppure XY),+ 18

1: 6.000- 8.000

Sindrome di Patau

47,XX(oppure XY),+ 13

1: 10.000

Sindrome di Turner

45,X

1: 5.000 femmine

Sindrome di Klinefelter

47,XXY

1: 1.000 maschi

Con il cariotipo è inoltre possibile individuare anche alterazioni di struttura dei cromosomi.

Le anomalie strutturali originano dalla rottura di uno o più cromosomi e, poiché queste rotture possono teoricamente avvenire ovunque nel genoma, il numero di potenziali riarrangiamenti è praticamente infinito.

I riarrangiamenti strutturali si dividono in due grandi gruppi : bilanciati e sbilanciati.

Le alterazioni cromosomiche strutturali bilanciate non danno luogo né a perdita né ad guadagno di materiale genetico e le persone portatrici sono generalmente fenotipicamente normali. Possono essere sia ereditate da un genitore (portatore sano) o possono verificarsi “de novo” e quindi essere riscontrate nelle solo nelle cellule fetali.

Le anomalie sbilanciate, invece, provocano perdita/guadano di materiale genetico, perciò vengono identificate in soggetti con fenotipo clinico. I principali tipi di anomalie strutturali sono:

1) Le delezioni, che consistono nella perdita di un segmento di un cromosoma, che può essere terminale o interstiziale. Di solito le sindromi da delezione interessano segmenti relativamente grandi di cromosoma (> 10 Mb = Megabasi). Delezioni di queste dimensioni possono essere identificate con tecniche di citogenetica tradizionale. Delezioni di dimensione inferiore, definite “microdelezioni”possono essere identificate solo con le più moderne tecniche di citogenetica molecolare (FISH) o di biologia molecolare (array-CGH).

2) Le duplicazioni consistono nella presenza di due copie di un segmento di cromosoma, e pertanto costituiscono delle trisomie parziali.

3) Le inversioni originano da 2 rotture che avvengono sullo stesso cromosoma e dalla successiva rotazione di 180° del segmento compreso tra i punti di rottura. Le inversioni producono un nuovo allineamento dei geni lungo l'asse di un cromosoma e di solito non si associano ad alterazioni cliniche.

4) Le traslocazioni reciproche, originano dalla rottura di due o, raramente, di più cromosomi e dallo scambio reciproco dei segmenti, senza perdita o acquisizione di materiale cromosomico, nel caso in cui sono bilanciate.

5) Le traslocazioni Robertsoniane, originano dalla fusione di due cromosomi acrocentrici, che si sono rotti al centromero od in prossimità di questo, senza perdita o acquisizione di materiale cromosomico, nel caso in cui sono bilanciate.

6) I cromosomi ad anello, detti anche ring, sono originati dalla rottura di entrambe le braccia di un cromosoma, perdita delle regioni distali alle rotture e riunione delle due estremità in una struttura ad anello, appunto. I ring possono essere soprannumerari, ed in tal caso il portatore avrà 47 cromosomi e sarà trisomico per le regioni comprese nel ring, oppure possono aver sostituito un cromosoma normale, ed in tal caso il portatore avrà 46 cromosomi ma sarà parzialmente monosomico, per la perdita delle regioni distali alle rotture. Poiché il segmento di cromosoma deleto di solito contiene numerosi geni, le conseguenze cliniche sono generalmente gravi.

7) I Markers o cromosomi marcatori, sono anomalie cromosomiche particolari di cui non si conosce l'espressività fenotipica, caratterizzate dalla presenza piccoli porzioni cromosomiche soprannumerarie di cui non si conosce l’origine, e cioè da quali cromosomi queste porzioni derivino.

Cariotipo Tradizionale

L’analisi citogenetica tradizionale comporta la coltura delle cellule fetali presenti nel liquido amniotico o nei villi coriali e la determinazione del cariotipo tramite l’analisi al microscopio dei cromosomi in metafase. Tale esame è caratterizzato da difficoltà tecniche e limiti diagnostici:

-  Tempi di attesa dei risultati: Le colture cellulari impongono lunghi tempi di attesa (15-20 giorni), necessari per lo sviluppo delle colonie di cellule fetali. Sebbene il nostro Centro offra la possibilità di ottenere una risposta rapida (24/48 ore) dalle aneuploidie cromosomiche più comuni (cromosomi 13, 18, 21, X e Y), mediante la tecnica molecolare avanzata di amplificazione genica Quantitative Fluorescent - Polimerase Chain Reaction o QF-PCR, i risultati sono parziali e comunque necessitano di una conferma dal cariotipo.

-  Rischio di mancanza di crescita della coltura: A volte è possibile che le cellule poste in coltura non crescano adeguatamente, con conseguente necessità di ripetizione del prelievo al fine di allestire nuove colture cellulari. Questo problema è ben conosciuto, sebbene non sia molto frequente; avviene infatti 1 volta su 500 in caso di cariotipo da liquido amniotico e 1 volta su 100 in caso di cariotipo da villi coriali.

- Limiti di risoluzione: l’esame standard non riesce ad evidenziare le anomalie strutturali inferiori a 10-15 Mb. Quindi, le patologie derivanti da alterazioni cromosomiche submicroscopiche (microdelezioni o microduplicazioni), il più delle volte sfuggono alla diagnosi.

- Necessità di approfondimenti diagnostici di 2^ livello: in alcuni casi si riscontrano anomalie cromosomiche particolari di cui non si conosce l'espressività fenotipica. Si tratta il più delle volte di piccoli porzioni cromosomiche soprannumerarie (markers), oppure anomalie cromosomiche strutturali come inversioni o traslocazioni, apparentemente bilanciate. In tali casi si richiede l'indagine sui genitori al fine di accertare se in uno di loro sia presente la stessa anomalia. Qualora ci si trovasse di fronte ad una mutazione "de novo" avvenuta nel feto, non si riuscirebbe a stabilire se nelle suddette anomalie strutturali vi sia stata perdita (delezione) o guadagno (duplicazione) di materiale genetico.

- Possibilità di artefatti "in vitro": il più delle volte riferibili a pseudomosaicismi. Questo può avvenire nel 2-3% delle colture.

Cariotipo Molecolare: Procedura

Il cariotipo da liquido amniotico viene effettuato mediante il prelievo di 15-20 ml di liquido amniotico per via trans-addominale, sotto controllo ecografico, tra la 15° e la 18° settimana di gestazione. Il liquido prelevato viene centrifugato per separare la parte liquida (che verrà utilizzata per il dosaggio dell’alfafetoproteina - AFP) dalla frazione corpuscolata, costituita dalle cellule fetali che sono in sospensione nel liquido amniotico. Tali cellule, definite amniociti, sono sottoposte ad estrazione del DNA.

Il cariotipo da Villi Coriali viene effettuato mediante il prelievo di 20 mg circa di villi coriali per via trans-addominale sotto controllo ecografico, tra la 11° e la 13° settimana di gestazione. Il materiale prelevato viene prima lavato ed osservato al microscopio per separare il tessuto materno dal tessuto fetale, e successivamente sottoposto ad estrazione del DNA, che verrà analizzato mediante tecnica array-CGH.

La tecnica array-CGH: Grazie ai recenti progressi della citogenetica molecolare è adesso possibile esaminare i cromosomi in maniera più approfondita ed accurata rispetto all’analisi citogenetica tradizionale, utilizzando il cosiddetto Cariotipo Molecolare, procedura diagnostica che impiega una tecnica molecolare innovativa conosciuta come array-CGH.

L’ibridazione genomica comparativa su microarray (Array - Comparative Genomic Hybridization o Array-CGH) è una tecnica sviluppata per identificare identificare anomalie cromosomiche di tipo numerico (aneuploidie) a carico dei 22 autosomi (cromosomi dal nr. 1 al nr. 22) e dei cromosomi sessuali (X e Y), o anche variazioni (Variazioni del numero di copie ”“ CNV) del contenuto di piccole porzioni cromosomiche, come duplicazioni/amplificazioni (presenza di copie in eccesso di segmenti di DNA), o delezioni (perdite di porzioni di genoma). Queste anomalie del DNA possono essere la causa di diverse patologie quali, ad esempio, sindromi malformative, ritardo mentale, autismo, epilessia e tumori.

Il principio su cui si basa la tecnica dell’Array CGH è la comparazione quantitativa del DNA in esame o DNA test (estratto dalle cellule fetali, in caso di diagnosi prenatale, o dal prelievo ematico del paziente, in caso di diagnosi post-natale) e del DNA genomico di riferimento proveniente da un soggetto sano (reference DNA).

Durante il processo analitico questi DNA sono marcati in maniera differenziale con molecole fluorescenti (generalmente si utilizza un fluorocromo rosso il DNA test ed un fluorocromo verde per il reference DNA) e, successivamente, vengono mescolati in parti uguali e fatti incubare (Ibridazione) su un microarray, costituito da un supporto di vetro la cui superficie è coperta di frammenti di DNA, noti come sonde o cloni. Ognuno di questi cloni rappresenta una specifica regione del genoma umano, fino a ricomprendere l’intero assetto cromosomico umano. Tanto più è elevato il numero di cloni maggiore è l'efficacia dell'array nell'identificazione delle variazioni del numero di copie. corrispondenti a piccole porzione di ciascun cromosoma. Il potere risolutivo della piattaforma utilizzata può variare in funzione della densità e della tipologia delle sonde utilizzate; attualmente per scopi diagnostici vengono impiegati array tra 1 Mb e 100 kb.

Al termine della suddetta incubazione, sia il DNA in esame che quello di controllo si legheranno ai cloni presenti sull’array. Il risultato sarà l’emissione di due distinti segnali fluorescenti le cui intensità saranno misurante a seguito di lettura degli arrays mediante un apposito strumento (scanner). Sull’immagine ottenuta verrà poi effettuata l’analisi comparativa tra le intensità di fluorescenza emesse dai due DNA e la relativa elaborazione dei dati mediante un apposito software, al fine evidenziare eventuali variazioni del numero di copie del DNA test.

In caso di assetto cromosomico normale, il rapporto tra le due emissioni è bilanciato (1:1). Qualora vi siano nel DNA in esame (fetale) delle delezioni (assenza di un cromosoma o parte di esso), il rapporto tra quest’ultimo ed il DNA di controllo sarà di 1:2 (monosomia completa o parziale). Nel caso di duplicazioni (presenza di un cromosoma soprannumerario o parte di esso) il rapporto tra il DNA embrionale e quello di controllo sarà di 2:1 (trisomia completa o parziale).

Risoluzione del cariotipo molecolare

Rispetto all'esame del cariotipo tradizionale, l'analisi molecolare dei cromosomi ha una risoluzione molto più elevata (~100 volte). Ciò consente di identificare anche patologie derivanti da alterazioni cromosomiche submicroscopiche, non evidenziabili tramite il cariotipo tradizionale, aumentando sensibilmente l’accuratezza dell’esame.

Il cariotipo molecolare, infatti, consente di studiare un gruppo di 100 patologie causate da microdelezione / microduplicazione cromosomica (es. Sindrome di DiGeorge, la Sindrome di Williams, la Sindrome di Praeder-Willi/Angelman) ed oltre 150 geni descritti nel database OMIM (vedi relazione tecnica).

Inoltre, grazie alla sofisticata analisi bioinformatica, che costituisce la fase terminale del processo analitico, si ha la possibilità di definire esattamente la regione genomica alterata, e quindi anche i geni in essa contenuti, permettendo di stabilire le conseguenze prodotte dall’anomalia cromosomica riscontrata.

Il cariotipo molecolare rappresenta anche la tecnica ideale di approfondimento diagnostico di 2^ livello, eseguita per integrare l’analisi citogenetica prenatale, particolarmente indicato nei casi di:

o difetti dello sviluppo fetale evidenziati tramite ecografia, riconducibili ad una patologia cromosomica, il cui cariotipo tradizionale è però risultato normale;

o feto con anomalie cromosomiche individuate attraverso l’analisi citogenetica tradizionale (riarrangiamenti sbilanciati, riarrangiamenti de novo apparentemente bilanciati e markers).

Limiti del cariotipo molecolare

I limiti di tale tecnica in ambito prenatale sono rappresentati dall’impossibilità di identificare riarrangiamenti cromosomici bilanciati (non patologici) e i mosaicismi (cioè la presenza cioè di due linee cellulari con differente assetto cromosomico) con una linea cellulare scarsamente rappresentata (inferiore al 10% circa).

Diagnosi Citogenetica

-  L’impossibilità di pervenire ad una diagnosi può verificarsi in rarissimi casi, per motivi generalmente correlati alla massiva presenza di sangue o meconio.

- Esiste la possibilità di errore diagnostico, limitata a rarissimi casi, dovuto a discordanza fra l’esito della diagnosi citogenetica prenatale ed il cariotipo riscontrato alla nascita. Tale discordanza può essere imputata a cause diverse: contaminazione del campione con cellule di origine materna, mosaici a bassa percentuale o presenza di anomalie cromosomiche di struttura di dimensioni inferiori ai limiti di risoluzione della tecnica.

- Qualora si riscontrasse una anomalia cromosomica fetale verranno comunque valutate le possibili implicazioni e gli effetti sul feto. In quelle situazioni in cui tale valutazione è estremamente complessa, potrà essere formulata soltanto sulla base di stime di rischio empiriche. i chiarimenti del caso saranno forniti in sede di consulenza.

- In caso di esito patologico, la paziente può scegliere direttamente l’interruzione volontaria di gravidanza se la diagnosi è definitiva, oppure, qualora il Genetista lo ritenesse necessario, potrebbero essere richiesti ulteriori approfondimenti. Per la legge italiana che regola l’interruzione volontaria della gravidanza (Legge 194/78), la richiesta di interruzione per la gestante a cui venga fatta diagnosi di grave anomalia fetale, dopo i primi 90 giorni e prima della 22° settimana di gestazione, è subordinata all’accertamento medico della condizione di grave minaccia alla salute psichica della gestante costituita dalla prosecuzione della gestazione.

- Esistono difetti congeniti che, non essendo associati ad anomalie cromosomiche, non possono essere diagnosticati mediante l’analisi citogenetica prenatale.

Necessità di approfondimenti diagnostici di 2^ livello

E’ possibile che il risultato richieda , per una sua più corretta interpretazione, l’estensione dell’esame citogenetico ai genitori.

Analisi integrative

Su specifica richiesta è possibile effettuare, sullo stesso campione fetale, oltre allo studio del cariotipo tradizionale o molecolare, anche uno screening genetico multiplo, diretto alla diagnosi delle gravi malattie le malattie genetiche più frequenti nella popolazione Italiana, quali Fibrosi Cistica, Sindrome del Cromosoma X Fragile (ritardo mentale), Beta Talassemia, Sordità Congenita, Distrofia Muscolare di Duchenne-Becker, Distrofia Miotonica (e tante altre malattie genetiche) e l’analisi rapida delle principali aneuploidie (trisomia 21, 13 e 18) mediante tecnica QF-PCR.

Tempi di attesa per i risultati

Essendo una tecnica molecolare, che non necessita di coltura cellulare, con il Cariotipo Molecolare è possibile ottenere un’analisi cromosomica approfondita (risoluzione 600 Kb) in circa 3 giorni. Tali termini possono comunque prolungarsi in caso di ripetizioni dell’esame o approfondimenti diagnostici (analisi dei genitori) o dubbi interpretativi.

Esperienza del Centro in diagnosi prenatale

Il Gruppo GENOMA può vantare una tra le più vaste esperienze a livello europeo nel settore delle analisi di citogenetica prenatale e post-natale e della biologia molecolare. Grazie alla integrazione delle competenze del Consultorio di Genetica Srl, uno dei primi e più importanti laboratori di citogenetica tradizionale e molecolare del territorio nazionale, il Gruppo Genoma può contare su oltre 30 anni di attività ed esperienza nel settore della diagnosi prenatale.

Nel campo della citogenetica tradizionale (cariotipo) sono oltre 90.000 i casi ad oggi diagnosticati su cellule di liquido amniotico, più di 10.000 quelli su campioni di villi coriali e oltre 40.000 i casi su linfociti di sangue periferico, per un totale di oltre 140.000 determinazioni di cariotipo, mentre per quanto riguarda la diagnostica molecolare, i casi ad oggi eseguiti sono oltre 300.000, che assieme alla casistica di citogenetica superano i 440.000 casi effettuati.

Elenco delle 100 patologie causate da microdelezione/microduplicazione cromosomica e degli oltre 150 geni descritti nel database OMIM, che vengono investigati con il cariotipo molecolare:

Syndromic regions incidence critical genes
1p36 deletion syndrome 1/5,000 /
1q41q42 microdeletion syndrome unknown DISP1
2p15-16.1 microdeletion syndrome unknown BCL11A
2p24.3 Feingold syndrome unknown MYCN
2q23.1 microdeletion syndrome unknown MBD5, EPC2
2q33.1 deletion (Glass syndrome) unknown STAB2
2q37 deletion syndrome <1/10,000 HDAC4
3pter-p25 deletion syndrome unknown CNTN4, ITPR1, SRGAP3, VHL
3q24 Dandy-Walker syndrome 1/100,000 ZIC1, ZIC4
3q29 deletion/duplication syndrome unknown FBXO45, PAK2, DLG1
4p16.3 deletion syndrome (Wolf-Hirschhorn) 1/20,000 - 1/50,000 LETM1, WHSC1
4q21 deletion syndrome unknown PRKG2, RASGEF1B
4q25 Rieger syndrome, type 1 unknown PITX2
5p deletion syndrome (Cri du chat) 1/20,000 - 1/50,000 CTNND2, TERT
5p13.2 Cornelia de Lange Syndrome 1 1/62,500 NIPBL
5q14.3 deletion syndrome unknown MEF2C
5q35 deletion syndrome (Sotos) 1-9/100,000 NSD1
6q13-q14 deletion syndrome unkown COL12A1
7q11.23 deletion syndrome (Williams-Beuren) 1/10,000 ELN
8p22 kabuki syndrome 1/32,000
8p23.1 deletion syndrome unknown GATA4
8q21.11 Microdeletion Syndrome unknown ZFHX4, PEX2
8q21.3-q22.1 Microdeletion unknown
8q24.1 deletion syndrome (Langer-Giedion) unknown TRPS1, EXT1
9q22.3 Microdeletion unknown
9q34.3 deletion syndrome (Kleefstra) unknown EHMT1
10p14p13 deletion syndrome (DiGeorge type 2) unknown GATA3
10q11.21 Hirschsprung Disease, susceptibility to, 1; HSCR1 1/5,000 RET
11p13 deletion syndrome (WAGR) unknown PAX6, WT1
11p11.2 deletion syndrome (Potocki-Shaffer) unknown ALX4
11p15.5 Beckwith-Wiedemann syndrome 1/13,700 H19, IGF2
11q deletion syndrome (Jacobsen) 1/100,000 /
14q12 microdeletion syndrome unknown FOXG1
15q11q13 deletion syndrome (Prader-Willi) 1/25,000 SNRPN
15q11q13 deletion syndrome (Angelman) 1/10,000 - 1/20,000 UBE3A
15q24 deletion/duplication syndrome unknown /
16p deletion syndrome (ATR-16) unknown HBA1, HBA2
16p13.3 Polycystic kidney disease, infantile severe, with tuberous sclerosis;PKDTS unknown PKD1
16p11-p12.1 microdeletion unknown
16q24.1 microdeletion syndrome unknown FOXF1, FOXC2
17p13.3 deletion syndrome (Miller dieker) unknown PAFAH1B1, YWHAE
17p11.2 deletion syndrome (Smith-Magenis) 1/25,000 RAI1
17p11.2 duplication syndrome (Potocki Lupski) unkown RAI1
17p12 Charcot-Marie-tooth Disease; CMT1A unkown PMP22
17p12 Neuropathy hereditary with liability to pressure palsies; HNPP unkown PMP22
17q11.2deletion/duplication syndrome unkown NF1, SUZ12
17q12 microdeletion unkown
17q21.31 deletion syndrome (Koolen-De Vries) 1/16,000 KANSL1
17q23.1-q23.2 deletion syndrome unknown TBX2, TBX4
17q24.3 Campomelic Dysplasia unknown SOX9
19q13.11 deletion syndrome unknown LSM14A, UBA2
20p12.2 Alagille syndrome 1 unknown JAG1
20q13.13-q13.2 microdeletion unknown
Down Sndrome critical region (21q22.12q22.2) 1/650 - 1,000 /
22 partial tetrasomy (Cat eye) 1/50,000 - 1/150,000 /
22q11.2 deletion syndrome (DiGeorge) 1/2,000 - 1/4,000 HIRA, TBX1
22q11.2 distal deletion syndrome unknown MAPK1
22q13.3 deletion syndrome unknown
Xp11.3 deletion syndrome unknown RP2
Xp11.22 microduplication syndrome unknown HUWE1
Xp22.31 Ichthyosis, x-linked unknown STS
Xp22.31 kallmann syndrome 1 unknown KAL1
Xp22.33 Leri-Weill Dyschondrosteosis; LWD unknown SHOX
Xq12 deletion/duplication (OPHN1) unknown OPHN1
Xq13.1 Charcot-Marie-tooth Disease; CMTX1 unknown GJB1
Xq22.3 deletion syndrome (AMME COMPLEX) unknown COL4A5, ACS4
Xq27.3 Fragile X Mental Retardation syndrome unknown FMR1
Xq28 duplication syndrome unknown MECP2