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La tecnica Array-CGH

Cariotipo molecolare (Microarray)
La tecnica Array-CGH
 
L’ibridazione genomica comparativa su microarray (Array - Comparative Genomic Hybridization o Array-CGH) è una tecnica sviluppata per identificare identificare anomalie cromosomiche di tipo numerico (aneuploidie) a carico dei 22 autosomi (cromosomi dal nr. 1 al nr. 22) e dei cromosomi sessuali (X e Y), o anche variazioni (Variazioni del numero di copie ”“ CNV) del contenuto di piccole porzioni cromosomiche, come duplicazioni/amplificazioni (presenza di copie in eccesso di segmenti di DNA), o delezioni (perdite di porzioni di genoma). Queste anomalie del DNA possono essere la causa di diverse patologie quali, ad esempio, sindromi malformative, ritardo mentale, autismo, epilessia e tumori.

Il principio su cui si basa la tecnica dell’Array CGH è la comparazione quantitativa del DNA in esame o DNA test (estratto dalle cellule fetali, in caso di diagnosi prenatale, o dal prelievo ematico del paziente, in caso di diagnosi post-natale) e del DNA genomico di riferimento proveniente da un soggetto sano (reference DNA).

Durante il processo analitico questi DNA sono marcati in maniera differenziale con molecole fluorescenti (generalmente si utilizza un fluorocromo rosso il DNA test ed un fluorocromo verde per il reference DNA) e, successivamente, vengono mescolati in parti uguali e fatti incubare (Ibridazione) su un microarray, costituito da un supporto di vetro la cui superficie è coperta di frammenti di DNA, noti come sonde o cloni. Ognuno di questi cloni rappresenta una specifica regione del genoma umano, fino a ricomprendere l’intero assetto cromosomico umano. Tanto più è elevato il numero di cloni maggiore è l'efficacia dell'array nell'identificazione delle variazioni del numero di copie. corrispondenti a piccole porzione di ciascun cromosoma. Il potere risolutivo della piattaforma utilizzata può variare in funzione della densità e della tipologia delle sonde utilizzate; attualmente per scopi diagnostici vengono impiegati array tra 1 Mb e 100 kb.

Al termine della suddetta incubazione, sia il DNA in esame che quello di controllo si legheranno ai cloni presenti sull’array. Il risultato sarà l’emissione di due distinti segnali fluorescenti le cui intensità saranno misurante a seguito di lettura degli arrays mediante un apposito strumento (scanner). Sull’immagine ottenuta verrà poi effettuata l’analisi comparativa tra le intensità di fluorescenza emesse dai due DNA e la relativa elaborazione dei dati mediante un apposito software, al fine evidenziare eventuali variazioni del numero di copie del DNA test.

In caso di assetto cromosomico normale, il rapporto tra le due emissioni è bilanciato (1:1). Qualora vi siano nel DNA in esame (fetale) delle delezioni (assenza di un cromosoma o parte di esso), il rapporto tra quest’ultimo ed il DNA di controllo sarà di 1:2 (monosomia completa o parziale). Nel caso di duplicazioni (presenza di un cromosoma soprannumerario o parte di esso) il rapporto tra il DNA embrionale e quello di controllo sarà di 2:1 (trisomia completa o parziale).

I Vantaggi della tecnica Array-CGH La citogenetica tradizionale, pur utilissima nell’individuare un gran numero di anomalie cromosomiche, numeriche e strutturali, è necessariamente limitata nelle sue possibilità diagnostiche dal potere di risoluzione del microscopio.

Soprattutto nelle malattie genetiche caratterizzate da vari dismorfismi e/o ritardi mentali, l’analisi del cariotipo con tecnica citogenetica tradizionale, a causa del suo basso potere di risoluzione, potrebbe risultare normale malgrado il un fenotipo chiaramente patologico.

Il maggiore progresso degli ultimi anni, nel campo della citogenetica, e’ rappresentato dallo sviluppo della tecnica FISH (Fluorescence In Situ Hybridation), una metodologia citochimica che consente di individuare specifiche sequenze di DNA a livello cromosomico. Il principio su cui si basa è l’appaiamento tra una sonda marcata (frammento di DNA specifico per la regione d’interesse contenente nucleotidi modificati) ed il DNA cromosomico del soggetto in studio, fissato su un vetrino. Tale tecnica permette di identificare marcatori cromosomici, di visualizzare traslocazioni bilanciate e non bilanciate, duplicazioni e riarrangiamenti cromosomici.

Un esempio di applicazioni della metodica FISH nella diagnostica clinica è rappresentato dallo studio della sindrome di DiGeorge, una malattia congenita causata da una serie di anomalie a carico del cromosoma 22 . Nello studio di tale patologia, la maggior parte gli individui affetti da sindrome di DiGeorge presentava un assetto cromosomico normale all’analisi citogenetica convenzionale. Quando sequenze di DNA relative a regioni del cromosoma 22 coinvolte in tale sindrome sono state clonate, marcate ed utilizzate per l’indagine FISH, in piu’ di 3⁄4 degli individui affetti sono state evidenziate delezioni cromosomiche: la maggior parte di queste, risultate troppo piccole per essere visibili nelle preparazioni citogenetiche standard, sono state facilmente evidenziabili dall’assenza di un segnale FISH su un cromosoma omologo.

La FISH, nonostante sia di grande applicazione nella diagnosi clinica odierna, è necessariamente limitata dal fatto di essere una tecnica di "indagine mirata": la sua applicazione consente solo di poter individuare mutazioni specifiche a livello di precisi loci cromosomici.

Con l’impiego della tecnica Array-CGH si è grado di valutare la presenza di eventuali anomalie cromosomiche a livello dell’intero genoma in un unico esperimento, senza sapere in anticipo cosa cercare.

Rispetto ad altre metodiche di indagine, come l'esame tradizionale del cariotipo, l'analisi del genoma basata su array ha una risoluzione molto più elevata (100 volte). Ciò consente di evidenziare anomalie del DNA che normalmente non potrebbero essere rilevate, incrementando notevolmente le possibilità di raggiungere una diagnosi certa. Inoltre, l'array-CGH permette di definire esattamente la regione genomica alterata e quindi anche i geni in essa contenuti, migliorando la comprensione delle relazioni esistenti tra variazioni del numero di copie e patologia.



Questo tecnica viene prevalentemente utilizzata per la diagnosi di fenotipi complessi associati a ritardo mentale di grado variabile. Tuttavia, l’Array-CGH trova impiego anche come tecnica di routine nella diagnosi prenatale, ed è particolarmente indicata per pazienti con feto i cui segni ecografici sono riconducibili ad una patologia cromosomica, il cui cariotipo è però risultato normale. I limiti di tale tecnica in ambito prenatale sono rappresentati dall’impossibilità di identificare riarrangiamenti cromosomici bilanciati e mosaicismi con una linea cellulare scarsamente rappresentata (inferiore al 10%).

La tecnologia microarray rappresenta oggi uno strumento fondamentale per il raggiungimento di una corretta diagnosi di laboratorio per diverse malattie genetiche.

Indicazioni all’uso della tecnica array-CGH
L’Array-CGH viene prevalentemente utilizzata per la diagnosi di fenotipi complessi associati a ritardo mentale di grado variabile.

Questo tecnica anche trova impiego anche come tecnica di routine nella diagnosi prenatale, ed è particolarmente indicata per pazienti con feto i cui segni ecografici sono riconducibili ad una patologia cromosomica, il cui cariotipo è però risultato normale. In questi casi, l’array-CGH  rappresenta una procedura ideale di approfondimento diagnostico di secondo livello, eseguita per integrare l’analisi citogenetica prenatale, al fine di definire più accuratamente eventuali anomalie cromosomiche precedentemente identificate o per rivelare microriarrangiamenti non evidenziabili con l'indagine del cariotipo fetale. L'integrazione dell'analisi citogenetica convenzionale con l'array-CGH incrementa notevolmente le possibilità di determinare le cause della patologia riscontrata nel feto ed eventualmente permette di definire più accuratamente il rischio di ricorrenza.

Le principali indicazioni per l’impiego dell’array-CGH quale tecnica di approfondimento diagnostico in diagnosi prenatale sono le seguenti: Difetti dello sviluppo fetale evidenziati tramite ecografia;
Anomalie cromosomiche (riarrangiamenti sbilanciati, riarrangiamenti apparentemente bilanciati de novo e cromosomi marcatori) individuate attraverso l’analisi citogenetica prenatale;
Aborti spontanei e terapeutici

L’array specificatamente utilizzato in diagnosi prenatale è costituito da cloni che coprono le regioni critiche interessate da microdelezioni associate a un gran numero di sindromi che non possono essere diagnosticate con un cariotipo tradizionale, come la Sindrome di DiGeorge (VCFS), la Sindrome di Williams, la Sindrome di Praeder-Willi/Angelman. Oltre ai cloni per sindromi da microdelezione, nel chip sono compresi anche cloni per le regioni subtelomeriche.

Particolare importanza riveste questa applicazione pre-natale nell’esame del liquido amniotico o dei villi coriali in quanto con una sola determinazione è possibile rilevare circa 100 patologie non diagnosticabili diversamente, che provocano ritardo mentale e patologie correlate nel bambino.

I limiti di tale tecnica in ambito prenatale sono rappresentati dall’impossibilità di identificare riarrangiamenti cromosomici bilanciati e mosaicismi con una linea cellulare scarsamente rappresentata (inferiore al 10%).

E’ importante sottolineare la necessità che questa tecnica sia utilizzata da laboratori dotati di provata competenza di genetica molecolare, nonché di esperienza nella interpretazione dei risultati prodotti dalla array-CGH.

La identificazione di uno sbilanciamento genomico richiede la conferma attraverso altre tecniche quali la ibridazione in situ o la PCR quantitativa e la estensione delle indagini ai genitori.

Dettaglio del cromosoma 22 da cariotipo fetale con Sindrome  da delezione 22q11.2 (la porzione cromosomica deleta è evidenziata in rosso)
 
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