Diagnosi Genetica Preimpianto (PGD)

La Diagnosi Genetica Preimpianto (PGD)

Le coppie ad elevato rischio di trasmissione di malattie genetiche sono di solito consigliate di ricorrere alla diagnosi prenatale (villocentesi o amniocentesi), in maniera tale da permettere la identificazione delle anomalie genetiche entro le prime 10-16 settimane di gestazione. Entrambe le procedure prevedono il campionamento di cellule fetali, dalle quali potrà essere estratto il DNA per effettuare l’analisi di mutazione di specifici geni e/o la determinazione del cariotipo fetale.

Sebbene le tecniche di diagnosi prenatale rappresentino oggi delle procedure più che idonee per evitare la nascita di bambini affetti da malattie genetiche, le coppie che vi fanno ricorso devono affrontare una interruzione terapeutica della gravidanza nel caso in cui venga individuato un feto affetto dalla specifica malattia. L’esperienza disponibile, inoltre, evidenzia che molte coppie affrontano ripetute interruzioni di gravidanza prima di generare un bambino non malato. Quindi, la possibilità di una scelta alternativa alla diagnosi prenatale risulterebbe molto utile per quelle coppie che vorrebbero evitare il ricorso ad una interruzione della gravidanza.

Bisogna inoltre considerare che, in alcune popolazioni, la diagnosi prenatale non è facilmente accettabile a causa di problemi etico/morali o religiosi associati all’interruzione della gravidanza.

Con l’evolversi delle tecniche di fertilizzazione in vitro (IVF) la Diagnosi Genetica Preimpianto (PGD) si è proposta come una nuova metodologia intesa ad identificare, prima dell’impianto in utero, la presenza di malattie genetiche nell’embrione generato in vitro da coppie ad elevato rischio riproduttivo. La possibilità di diagnosticare una malattia genetica nell’embrione, prima dell’impianto, evita così il ricorso all’interruzione di gravidanza terapeutica, spesso devastante dal punto di vista psicologico e non sempre accettata dal punto di vista etico/morale.

I pazienti che richiedono la PGD, quindi, verranno sottoposti alle procedure di IVF per permettere la manipolazione dell’embrione 3 giorni dopo la fertilizzazione, prima del relativo impianto in utero. E’ importante ottenere dal ciclo IVF un adeguato numero di embrioni al fine di aumentare le probabilità di identificarne almeno uno o due che risultino all’analisi genetica privi della specifica malattia ricercata. Una o due cellule (blastomeri) vengono rimossi da ciascun embrione e sottoposti ad analisi genetica; se i blastomeri prelevati risulteranno non affetti dalla malattia, si potranno dunque trasferire nell’utero della madre, ottenendo così una gravidanza esente dalla specifica malattia.

Lo sviluppo delle conoscenze sul genoma umano, con l’identificazione di nuovi geni coinvolti nell’insorgenza di malattie ereditarie, unitamente all’avanzamento della tecnologia strumentale, ha notevolmente esteso il campo di applicazione della PGD.

Dal primo caso di PGD di fibrosi cistica eseguito nel 1992, le strategie diagnostiche si sono evolute notevolmente, e di conseguenza si è avuta una consistente crescita del numero di malattie alle quali è stata applicata la PGD. Ad oggi esistono protocolli diagnostici per oltre 30 malattie monogeniche, autosomiche dominanti, recessive o legate al cromosoma X.

Patologie genetiche molto diffuse in cui la PGD oggi trova una valida applicazione comprendono Beta-Talassemia, Anemia Falciforme, Emofilia A e B, Distrofia Muscolare di Duchenne-Becker, Distrofia Miotonica, Fibrosi Cistica, Atrofia Muscolare Spinale (SMA), Sindrome di Lesch-Nyhan, Malattia di Charcot-Marie-Tooth, Alfa-1-Antitripsina e X-Fragile.

Il laboratorio GENOMA, ha effettuato il primo caso di PGD nel 1998, in una coppia a rischio di Fibrosi Cistica.

Un bilancio significativo quello della Sezione PGD del Laboratorio GENOMA, che si concretizza in un numero di casi di PGD sinora condotti superiore ad 120, una intensa collaborazione scientifica con prestigiosi istituti internazionali e nel continuo confronto con la Comunità Scientifica Internazionale. I biologi molecolari della Sezione sono stati autori di diverse pubblicazioni scientifiche su riviste internazionali specializzate, presenziando in qualità di speaker a numerosi congressi nazionali ed internazionali (ESHRE, International Symposium on Preimplantation Genetics, etc)..

Nell’esecuzione della Diagnosi Genetica Preimpianto si avvale di una dotazioni strumentali che rappresentano quanto di più moderno e tecnologicamente avanzato sia oggi reperibile, impiegando metodi analitici sofisticati ed innovativi.

Queste caratteristiche hanno consentito a Laboratorio GENOMA di divenire il Centro italiano più qualificato nel settore della diagnosi genetica preimpianto, punto di riferimento di diversi Centri di fecondazione assistita, sia nazionali che internazionali.

Le malattie genetiche sinora diagnosticate dal Ns. Centro in PGD sono le seguenti:

Disease	No.	Disease	No.
Cystic Fibrosis	23	Duchenne/Becker Muscular Dystrophy	8
Beta Thalassemia	41	Sickle Cell Anemia	6
Retinoblastoma	3	Wiskott-Aldrich	1
Hemophilia A	5	Charcot Marie Tooth X-linked (CMTX)	1
Hemophilia B	3	Alzheimer	1
Spinal Muscular Atrophy (SMA)	5	Alpha-Thalassemia Mental Retardation Syndrome, X-Linked (ATRX)	1
Myotonic Dystrophy	6	Beta Thalassemia + HLA matching	15
Holt-Horam Syndrome	1	HLA matching	2
Lesch-Nyhan Syndrome	1	21-Idroxilase	1
Neurofibromatosis	2	Primary Dystonia	1

I risultati ottenuti sono stati i seguenti:

PGD per malattie mologeniche	123
PGD per malattie mologeniche + Tipizzazione HLA	15
PGD per Tipizzazione HLA	2
Gravidanze sane ottenute	29
Bambini già nati	19
Diagnosi errate	0

PGD mediante analisi del DNA:
Quali patologie Ã© possibile diagnosticare?

Tutte quelle patologie, autosomiche dominanti, recessive o X-linked, per le quali Ã© stato identificato il gene responsabile. Il Ns. Centro dispone di un gruppo di ricerca che è in grado di studiare e ottimizzare per la successiva PGD anche casi di malattie genetiche rare in cui non è disponibile la relativa diagnosi genetica. In quest'ultimo caso, il gruppo di ricerca del Laboratorio Genoma provvederà a studiare il gene responsabile della malattia, determinando la sua sequenza ed effettuandone l'analisi di mutazione al fine di identificare la/le alterazione/i causa dell'anomalia genetica. Successivamente, quindi, verrà studiata ad hoc una strategia idonea per la diagnosi genetica preimpianto delle specifiche mutazioni presenti nella coppia.

Di seguito viene riportata una tabella riepilogativa, riguardante le più frequenti malattie genetiche diagnosticabili in PGD.

Tabella 1. Malattie genetiche trasmissibili alla prole che possono essere analizzate mediante diagnosi genetica dopo biopsia degli ovociti ed embrioni.
Acondroplasia	Malattia del core centrale
Agammaglobulinemia	Malattia di Gaucer
Anemia falciforme	Malattia di Huntington
Anemia di Fanconi	Malattia di Alport
Atrofia muscolare spinale / bulbare	Malattia di Tay-Sachs
Deficienza di antitripsina a1	MELAS
Deficienza della catena lunga dell’enzima idrossiacil CoA deidrogenasi	Miopatia miotubolare legata al cromosoma X
Deficienza dell’enzima ornitina-transcarbamilasi	Neurofibromatosi I e II
Deficienza della proteina trifunzionale mitocondriale	Neoplasia endocrina multipla tipo II
Displasia efiseale multipla	Osteogenesi imperfetta I e IV
Distrofia miotonica	Poliposi coli adenomatoso familiare
Distrofia muscolare di Becker	Retinite pigmentosa
Distrofia muscolare di Duchenne	Rhesus (Rh D)
Emofilia A e B	Sclerosi tuberosa
Epidermolisi bullosa	Sindrome di Cruzon
Esclusione HD	Sindrome di Di George
FAP-Gardner	Sindrome di Hunter MPS II
Fenilchetonuria	Sindrome di Lesch-Nyhan
Fibrosi cistica	Sindrome di Marfan
Idrocefalo legato al cromosoma X	Sindrome oro-facciale-digitale tipo 1
Incontinentia pigmenti	Sindrome di Stickler
Ipoglicemia iperinsulinemica PHH1	Sindrome dell’ X fragile
Insorgenza precoce malatia di Alzheimer	Sindrome di Wiskott-Aldrich
Malattia di Charcot-Marie-Tooth 1° e 2A	Talassemia beta

Come si esegue la PGD?

Per l’esecuzione della PGD prevede i seguenti steps:

Induzione dell'ovulazione;
Prelievo di ovuli maturi
Fecondazione in vitro mediante iniezione intracitoplasmatica (ICSI)
Biopsia dell’embrione
Analisi genetica del Blastomero
Impianto degli embrioni in utero

Induzione dell'ovulazione

Il primo passaggio è rappresentato da una stimolazione ovarica. La maggior parte di pazienti che eseguono cicli di concepimento assistito non hanno problemi ovulatori. Lo scopo di questa stimolazione è di indurre, nel ciclo prescelto, una maturazione contemporanea di più follicoli per poter avere a disposizione più ovociti e possibilmente più embrioni da trasferire. Questa superovulazione può essere ottenuta utilizzando varie sostanze a seconda dei differenti protocolli. Il controllo ecografico dell'ovaio permette di sapere quando le uova sono giunte a completa maturazione.

Prelievo di ovuli maturi

Il prelievo degli ovociti viene eseguito per via transvaginale, sotto controllo ecografico. In pratica si passa un sottile ago attraverso la vagina, e si pungono i numerosi follicoli ovarici per aspirare le uova perfettamente mature.Il liquido aspirato viene trasferito in laboratorio ed esaminato al microscopio per recuperare le uova da immergere immediatamente in un apposito liquido nutritivo.

Fecondazione in vitro mediante iniezione intracitoplasmatica (ICSI)

Con l'impiego di strumenti di alta precisione i biologi inseriscono un singolo spermatozoo all'interno dell'ovocita immobilizzato da una pipetta aspirante sotto il microscopio micromanipolatore.

Biopsia dell’embrione

La biopsia dell’embrione prevede la rimozione di una cellula (Blastomero) da un embrione allo stadio di 6 ”“ 8 cellule. Con l’embrione mantenuto in posizione dalla pipetta con i margini arrotondati, si apre un foro nell’involucro che contiene l’embrione utilizzando una soluzione opportuna, espulsa da una micropipetta posizionata in corrispondenza della cellula che si intende rimuovere. Una volta perforato l’involucro, si inserisce in posizione una nuova micropipetta di diametro maggiore rispetto all’anteriore, che consentirà, mediante aspirazione, la rimozione di una cellula che verrà poi rilasciata applicando una pressione negativa.Se la tecnica è eseguita correttamente non vi sono rischi per l’embrione, come comprovato da diversi studi eseguiti sugli animali e sull’uomo. La cellula rimossa viene poi inserita all’interno di una provetta per la successiva analisi genetica.

Analisi genetica del Blastomero

All’interno della provetta contenente il blastomero viene aggiunta una soluzione che consente la lisi della cellula, e quindi la liberazione del DNA dal nucleo cellulare.

Successivamente, mediante una reazione di amplificazione enzimatica in vitro conosciuta come Polymerase Chain reaction (PCR), si amplifica milioni di volte la regione genica d’interesse, coinvolta dalle mutazioni da ricercare.

Il prodotto di amplificazione genica viene quindi sottoposto ad analisi di mutazione per la ricerca delle mutazioni geniche presenti nella coppia.

L’analisi di mutazione rappresenta la fase più importante e delicata della PGD. Per garantire la massima affidabilità interpretativa è indispensabile che sia effettuata con metodiche e strumentazioni che permettono l’identificazione univoca delle mutazioni ricercate.

L'analisi di sequenza automatizzata rappresenta attualmente il miglior metodo di analisi genetica, in quanto consente l'esatta determinazione e visualizzazione diretta di una specifica mutazione. L'applicazione di tale tecnica alla PGD, viene eseguita impiegando sofisticate strumentazioni di ultima generazione, completamente automatizzate.

Di seguito vengono mostrati i risultati dell'analisi genetica di un caso di PGD di Beta Talassemia eseguito mediante la nuova metodica del Minisequencing messa a punto ed ottimizzata dal Ns. Laboratorio.

Impianto degli embrioni in utero (embrio transfer)

Dopo aver effettuato l’analisi di mutazione nei blastomeri in esame, vengono trasferiti alla paziente gli embrioni che sono risultati normali all’esame genetico, cioè privi delle mutazioni ricercate.

La metodica di trasferimento intrauterino è generalmente semplice e indolore: non richiede alcuna forma di anestesia o sedazione e consiste nell' introdurre un sottilissimo catetere (del diametro di circa 1-1,5 mm.) all' interno della cavità uterina attraverso il canale cervicale. E' una manovra comunque molto delicata in quanto è necessario evitare ogni stress agli embrioni ed alla mucosa che riveste la cavità uterina (endometrio).