I risultati ottenuti sono stati i seguenti:

PGD mediante analisi del DNA:
Quali patologie é possibile diagnosticare?

  Tutte quelle patologie,  autosomiche dominanti, recessive o X-linked, per le quali é stato identificato il gene responsabile. Il Ns. Centro dispone di un gruppo di ricerca che è in grado di studiare e ottimizzare per la successiva PGD anche casi di malattie genetiche rare in cui non è disponibile la relativa diagnosi genetica. In quest'ultimo caso, il gruppo di ricerca del Laboratorio Genoma provvederà a studiare il gene responsabile della malattia, determinando la sua sequenza ed effettuandone l'analisi di mutazione al fine di identificare la/le alterazione/i causa dell'anomalia genetica. Successivamente, quindi, verrà studiata ad hoc una strategia idonea per la diagnosi genetica preimpianto delle specifiche mutazioni presenti nella coppia.

Di seguito viene riportata una tabella riepilogativa, riguardante le più frequenti malattie genetiche diagnosticabili in PGD.  

Come si esegue la PGD?

Per l’esecuzione della PGD prevede i seguenti steps:

• Induzione dell'ovulazione;
• Prelievo di ovuli maturi
•  Fecondazione in vitro mediante iniezione intracitoplasmatica (ICSI)
• Biopsia dell’embrione
• Analisi genetica del Blastomero
• Impianto degli embrioni in utero

Induzione dell'ovulazione

Il primo passaggio è rappresentato da una stimolazione ovarica. La maggior parte di pazienti che eseguono cicli di concepimento assistito non hanno problemi ovulatori. Lo scopo di questa stimolazione è di indurre, nel ciclo prescelto, una maturazione contemporanea di più follicoli per poter avere a disposizione più ovociti e possibilmente più embrioni da trasferire. Questa superovulazione può essere ottenuta utilizzando varie sostanze a seconda dei differenti protocolli.  Il controllo ecografico dell'ovaio permette di sapere quando le uova sono giunte a completa maturazione.

Prelievo di ovuli maturi

Il prelievo degli ovociti viene eseguito per via transvaginale, sotto controllo ecografico. In pratica si passa un sottile ago attraverso la vagina, e si pungono i numerosi follicoli ovarici per aspirare le uova perfettamente mature.Il liquido aspirato viene trasferito in laboratorio ed esaminato al microscopio per recuperare le uova da immergere immediatamente in un apposito liquido nutritivo.

Fecondazione in vitro mediante iniezione intracitoplasmatica (ICSI)

Con l'impiego di strumenti di alta precisione i biologi inseriscono un singolo spermatozoo all'interno dell'ovocita immobilizzato da una pipetta aspirante sotto il microscopio micromanipolatore.

Biopsia dell’embrione

La biopsia dell’embrione prevede la rimozione di una cellula (Blastomero) da un embrione allo stadio di 6 ”“ 8 cellule. Con l’embrione mantenuto in posizione dalla pipetta con i margini arrotondati, si apre un foro nell’involucro che contiene l’embrione utilizzando una soluzione opportuna, espulsa da una micropipetta posizionata in corrispondenza della cellula che si intende rimuovere. Una volta perforato l’involucro, si inserisce in posizione una nuova micropipetta di diametro maggiore rispetto all’anteriore, che consentirà, mediante aspirazione, la rimozione di una cellula che verrà poi rilasciata applicando una pressione negativa.Se la tecnica è eseguita correttamente non vi sono rischi per l’embrione, come comprovato da diversi studi eseguiti sugli animali e sull’uomo. La cellula rimossa viene poi inserita all’interno di una provetta per la successiva analisi genetica.  

Analisi genetica del Blastomero

All’interno della provetta contenente il blastomero viene aggiunta una soluzione che consente la lisi della cellula, e quindi la liberazione del DNA dal nucleo cellulare.

Successivamente, mediante una reazione di amplificazione enzimatica in vitro conosciuta come Polymerase Chain reaction (PCR), si amplifica milioni di volte la regione genica d’interesse, coinvolta dalle mutazioni da ricercare.

Il prodotto di amplificazione genica viene quindi sottoposto ad analisi di mutazione per la ricerca delle mutazioni geniche presenti nella coppia.

L’analisi di mutazione rappresenta la fase più importante e delicata della PGD. Per garantire la massima affidabilità interpretativa è indispensabile che sia effettuata con metodiche  e strumentazioni che permettono l’identificazione univoca delle mutazioni ricercate.  

L'analisi di sequenza automatizzata rappresenta attualmente il miglior metodo di analisi genetica, in quanto consente l'esatta determinazione e visualizzazione diretta di una specifica mutazione. L'applicazione di tale tecnica alla PGD, viene eseguita impiegando sofisticate strumentazioni di ultima generazione, completamente automatizzate.  

Di seguito vengono mostrati i risultati dell'analisi genetica di un caso di PGD di Beta Talassemia eseguito mediante la nuova metodica del Minisequencing messa a punto ed ottimizzata dal Ns. Laboratorio.

Impianto degli embrioni in utero (embrio transfer)

  Dopo aver effettuato l’analisi di mutazione nei blastomeri in esame, vengono trasferiti alla paziente gli embrioni che sono risultati normali all’esame genetico,  cioè privi delle mutazioni ricercate.

La metodica di trasferimento intrauterino è generalmente semplice e indolore: non richiede alcuna forma di anestesia o sedazione e consiste nell' introdurre un sottilissimo catetere (del diametro di circa 1-1,5 mm.) all' interno della cavità uterina attraverso il canale cervicale. E' una manovra comunque molto delicata in quanto è necessario evitare ogni stress agli embrioni ed alla mucosa che riveste la cavità uterina (endometrio).