Le cellule da sottoporre ad analisi genetica possono essere ottenute sia dall’ovocita, attraverso il prelievo dei globuli polari (PB), che dall’embrione, mediante l’analisi dei blastomeri allo stadio di segmentazione o di blastocisti.
La tecnica di prelievo consiste nel praticare un foro nella zona pellucida, parete che avvolge l’ovocita e l’embrione fino allo stadio di blastocisti. Oggi, nei centri più all’avanguardia, la perforazione della zona pellucida viene effettuata mediante l’azione di un raggio laser.

Biopsia dei globuli polari (PB)
Gli ovociti, recuperati per via trans-vaginale dai follicoli ovarici, vengono esaminati al microscopio rovesciato e liberati dal cumulo ooforo. Gli ovociti maturi, ottimali per lo studio genetico, sono in metafase II, hanno gia’ espulso il primo globulo polare (1PB) (diploide), e sono idonei per la fecondazione in vitro. Dopo la fecondazione, poco dopo la penetrazione dello spermatozoo, l’ovocita espelle il secondo globulo polare (2PB) (aploide), completando così la sua maturazione con la seconda divisione meiotica.
I PB vengono prelevati con il micromanipolatore, al microscopio rovesciato, aspirandoli delicatamente mediante una micropipetta di vetro. Terminata la biopsia, l’ovocita viene rimesso in coltura, mentre ciascun globulo polare viene introdotto all’interno di una provetta analitica per la successiva analisi genetica. La diagnosi preimpianto puo’ essere effettuata sul primo globulo polare (1PB) o mediante analisi sequenziale del primo e del secondo globulo polare (2PB)(Verlinsky et al., 1990, 1997).




Biopsia dell’embrione
E’ la tecnica maggiormente usata dai centri che effettuano PGD. Il terzo giorno (day 3) dopo la fecondazione, l’embrione e’ solitamente allo stadio di 6 – 8 cellule (cleavage stage embryo). In questa fase le cellule sono totipotenti, non compattate e facilmente prelevabili. Il prelievo eseguito allo stadio di 2 o 4 cellule e’ stato abbandonato, perché la riduzione della massa totale dell’embrione in modo così drastico ne comprometteva lo sviluppo successivo.
Attraverso l’apertura creata nella zona pellucida si introduce una micropipetta di vetro da biopsia, e si aspirano delicatamente uno o due cellule (blastomeri) che vengono poi rilasciati nel terreno di coltura. I blastomeri così ottenuti vengono, quindi, sottoposti ad analisi citogenetica o molecolare. Se la tecnica è eseguita correttamente non vi sono rischi per l’embrione, come dimostrato da diversi studi eseguiti sugli animali e sull’uomo.



Biopsia della blastocisti
La blastocisti, che si forma a partire dal sesto giorno (day 6) dopo la fertilizzazione, contiene da 100 a 300 cellule e piu’. Il prelievo di cellule in questa fase e’ potenzialmente molto utile alla diagnostica, in quanto e’ possibile prelevare un discreto numero di cellule senza creare problemi allo sviluppo successivo dell’embrione. Inoltre dato che con la biopsia si prelevano cellule del trofoectoderma, la massa delle cellule interne, che dara’ origine al feto nelle fasi successive, non e’ danneggiata, con indiscussi vantaggi biologici ed etici.
La biopsia viene effettuata praticando un foro, con la tecnica precedentemente descritta, ed aspirando le cellule (circa 10 o 20) con una pipetta da biopsia o provocando una erniazione delle cellule del trofoectoderma all’esterno. Esistono tuttavia pochissimi dati sulle analisi da blastocisti e, sebbene siano state riportate nascite dopo biopsia allo stadio di blastocisti, attualmente la procedura e’ da ritenersi sperimentale.
 

Segue:Analisi genetica delle cellule embrionali o dei globuli polari