La tecnica FISH


L’assetto cromosomico dell’embrione può essere determinato tramite la tecnica di Ibridizazione Fluorescente In-Situ (FISH). La FISH e’ la tecnica più diffusa per la diagnosi di aneuoploidie su nuclei interfasici da singola cellula. Le cellule prelevate, siano esse PB o blastomeri, vengono fissate su vetrini da microscopia e fatte reagire con una soluzione contenente un cocktail di sonde di DNA marcate con fluorocromi colorati, con sequenza complementare specifica alle regioni cromosomiche che interessano la diagnosi. Tali sonde, in opportune condizioni, si legano alle regioni cromosomiche per cui presentano omologia, ed eccitate da lampade che emettono luce a diverse lunghezze d’onda, emettono un segnale fluorescente osservabile al microscopio a fluorescenza, di colore diverso per ciascun cromosoma. Attraverso la FISH è possibile stabilire lo stato di ploidia del blastomero rispetto ad un numero consistente di cromosomi.

La scelta di tali cromosomi si basa fondamentalmente sui dati degli aborti spontanei e comprende in genere i cromosomi X, Y, 13, 14, 15, 16, 18, 21 e 22, le cui trisomie sono associate ad elevati tassi di aborto o, addirittura, alla nascita di bambini gravemente malformati.



Limiti della tecnica FISH e rischio di errore diagnostico

Il margine di errore della tecnica FISH e’ sicuramente un problema rilevante. Infatti, anche in mani esperte, in taluni casi le percentuali di errore dovute a falsi positivi, falsi negativi posso raggiungere valori relativamente elevati (~7%).

Tali errori possono essere dovuti a colorazione di fondo, sovrapposizione dei segnali di ibridazione, segnali diffusi, segnali cosiddetti “splittati”, perdita del nucleo, o parte di esso, durante fissaggio.

Inoltre, bisogna tener conto del problema del mosaicismo, a causa del quale è possibile che cellule provenienti dallo stesso embrione presentino un differente cariotipo. In pratica può accadere che la cellula analizzata mediante PGD risulta normale all’analisi citogenetica, mentre altre cellule dello stesso embrione presentano invece alterazioni cromosomiche, o viceversa.

Tale fenomeno, negli embrioni, è relativamente frequente e può condurre ad errori di diagnosi. Pertanto la coppia deve essere preventivamente informata dei limiti tecnici della procedura, consigliando la conferma dei risultati della diagnosi mediante tecniche convenzionali di diagnosi prenatale.

Segue: Come si esegue la PGD?