Analisi genetica del blastomero per tipizzazione HLA

L’analisi genetica da singola cellula è una tecnica molto complessa, che richiede una notevole esperienza professionale e l’impiego di tecnologie strumentale avanzate. Dal punto di vista procedurale, la PGD è totalmente differente dalla diagnosi genetica prenatale.

 Infatti, dai prelievi dei tessuti fetali si estrae una notevole quantità di DNA, derivante da centinaia di migliaia di cellule. Inoltre, in caso vi sia un dubbio interpretativo e’ possibile di ripetere il test, poiché non vi sono restrizioni temporali ed e’ disponibile una cospicua quantità di cellule fetali.

Nella diagnosi preimpianto, invece, il materiale su cui viene eseguito l’esame genetico è rappresentato da una singola cellula (e quindi una sola copia di DNA); inoltre i tempi sono molto ristretti, in quanto l’esame deve essere completato in tempo utile per il transfer, entro il day 5. Com’è facilmente comprensibile, ciò incide notevolmente sulla scelta della strategia operativa da seguire, che deve essere rapida, precisa e deve fornire risultati univoci, in tempi estremamente rapidi.

Una volta introdotti i singoli blastomeri all’interno di differenti provette analitiche, si aggiunge una soluzione che consente la lisi delle cellule, e quindi la liberazione del DNA dal nucleo cellulare. Successivamente, mediante una reazione di amplificazione enzimatica in vitro, conosciuta come Polymerase Chain reaction (PCR), si amplifica milioni di volte la regione genica d’interesse (dove, cioè, sono localizzate le mutazioni che causano la specifica malattia e/o la regione HLA).

In pratica, considerando la molecola del DNA come un “grosso libro” e la regione genica d’interesse come una “pagina” di questo libro, con la metodica PCR si "fotocopia" milioni di volte questa “pagina”, fino ad ottenerne una quantità sufficiente per essere rilevata dalla strumentazione analitica. Dopo la reazione di amplificazione enzimatica, il prodotto di amplificazione viene quindi sottoposto ad analisi di mutazione per la ricerca delle mutazioni geniche presenti nella coppia. L’intera procedura viene solitamente completata entro 24 ore dalla fertilizzazione, in tempo per effettuare il transfer degli embrioni in day 4 o day 5.

L’analisi di mutazione rappresenta la fase più importante e delicata della PGD. Per garantire la massima affidabilità interpretativa è indispensabile che sia effettuata da personale qualificato, con notevole esperienza nel settore, e con l’impiego di metodiche e strumentazioni analitiche che permettono di ottenere una diagnosi univoca, che non lasci dubbi interpretativi. L'analisi di sequenza automatizzata, attualmente, rappresenta il miglior metodo di analisi genetica, in quanto consente l'esatta determinazione e visualizzazione diretta di una specifica mutazione (Fiorentino et al., 2003). L'applicazione di tale tecnica alla PGD, viene eseguita impiegando sofisticate strumentazioni di ultima generazione, completamente automatizzate.

Nell’immagine di cui sopra vengono mostrati i risultati dell'analisi genetica di un caso di PGD di Beta Talassemia eseguito mediante la nuova metodica del Minisequencing, ottimizzata dal Ns. Laboratorio e pubblicata nella rivista scientifica internazionale Molecular Human Reproduction.(Fiorentino et al., Molecular Human Reproduction Vol.9 No.7 pp. 399-410, 2003).

Per quanto riguarda la tipizzazione dell’HLA, la strategia diagnostica che si impiega su singola cellula è diversa da quella utilizzata su sangue periferico. L’approccio analitico per PGD, infatti, prevede una tipizzazione indiretta (analisi di linkage) mediante l’impiego di diversi marcatori genetici polimorfici Short Tandem Repeats (STR), localizzati lungo la regione HLA (fig. 1 e 2).

La genotipizzazione di questi markers permette di ottenere il profilo genetico specifico, per la regione HLA, del bambino affetto della coppia. Tale profilo verrà quindi ricercato anche nelle cellule embrionali; gli embrioni a cui verrà riscontrato il medesimo profilo genetico per la regione HLA del bambino della coppia, saranno diagnosticati come HLA-identici o HLA-compatibili e quindi considerati idonei per il transfer.
 

Segue: Descrizione tecnica della procedura